美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的一個(gè)團(tuán)隊(duì)拍攝到了一張?jiān)u委認(rèn)為“技術(shù)上接近完*”的幼年斑馬魚的照片。這張照片使用共聚焦顯微鏡和圖像堆疊技術(shù)創(chuàng)作完成。這些影像結(jié)合了研究、創(chuàng)造力、影像技術(shù)和專業(yè)知識(shí)，其中不少還是生物科學(xué)領(lǐng)域和顯微攝影技術(shù)運(yùn)用上的重要突破，值得好好欣賞!
你了解什么是共聚焦顯微鏡?
顯微鏡是人類*偉大的發(fā)明之一。從遠(yuǎn)古時(shí)代，人們就渴望看到更多肉眼看不到的事物。
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科研已開始由宏觀轉(zhuǎn)向微觀世界，與此同時(shí)，激光共聚焦顯微鏡也成為課題組內(nèi)經(jīng)常使用的儀器。
熒光顯微鏡為啥不香?
在生物學(xué)研究中，科學(xué)家們常常利用能發(fā)射熒光的熒光分子作為生物標(biāo)記。將這種熒光分子通過(guò)化學(xué)方法掛在其他不可見(jiàn)的分子上，原來(lái)不可見(jiàn)的部分就變得可見(jiàn)了。生物學(xué)家一直利用這種標(biāo)記方法，把原本透明的細(xì)胞或細(xì)胞器從黑暗的顯微鏡視場(chǎng)中‘揪出來(lái)’。熒光壽命可以反映細(xì)胞生命活動(dòng)的環(huán)境參量，例如環(huán)境PH值、離子濃度、含氧量等，同時(shí)也是區(qū)分熒光蛋白分子、反映熒光蛋白分子動(dòng)力學(xué)特征的重要參數(shù)，在細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)室里有熒光顯微鏡還要去用共聚焦顯微鏡呢?因?yàn)楣簿劢癸@微鏡成像效果比熒光顯微鏡好太多。
看這張熒光顯微鏡與共聚焦拍的細(xì)胞核和細(xì)胞骨架對(duì)比圖，是不是感覺(jué)就像近視的你忘記戴眼鏡和戴了眼鏡看到的效果呢?隨著大家越來(lái)越關(guān)注活體及活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，加上傳統(tǒng)活細(xì)胞工作站在分辨率上的限制，共聚焦無(wú)疑成為大家的方案。主要原因有：
1、分辨率高;
2、光毒性小很多，適合活細(xì)胞實(shí)驗(yàn);
3、檢測(cè)靈敏度非常高，成像速度也非常快。
共聚焦顯微鏡與熒光顯微鏡相比升級(jí)了激光光源、光電倍增管檢測(cè)器并在檢測(cè)器前加裝了針孔，在硬件上實(shí)現(xiàn)了物鏡觀察到的樣品焦點(diǎn)--針孔--檢測(cè)器三點(diǎn)共軛避免了非焦平面雜散光的干擾，拍圖時(shí)還能再做光學(xué)放大、平均降噪、平均疊加等設(shè)置讓我們輕輕松松得到像圖中那樣的高清圖片。
結(jié)論
激光掃描共聚焦顯微鏡是在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上采用激光作為光源，通過(guò)使用激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像處理的現(xiàn)代化光學(xué)顯微鏡。
它能以極高的分辨率采集細(xì)胞或組織內(nèi)部的熒光標(biāo)記圖像、觀察細(xì)胞或組織內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)變化、在亞細(xì)胞水平觀察胞內(nèi)重要離子濃度或 pH 的變化、結(jié)合電生理技術(shù)觀察和記錄細(xì)胞的生理活動(dòng)。使用激光掃描共聚焦顯微鏡，還可以對(duì)觀察樣品進(jìn)行斷層掃描和成像、重構(gòu)和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。
共聚焦顯微鏡原理
激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式，采用激光束作掃描光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對(duì)標(biāo)本焦平面逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像。
掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)，通過(guò)控制調(diào)焦深度，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示所觀察表面的立體結(jié)構(gòu)。
激光共焦光學(xué)系統(tǒng)僅接收通過(guò)圓形針孔聚焦的光線，并非采集從樣品上反射和散射的所有光線。這樣有助于消除模糊，且由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響，讓其能夠獲得比普通顯微鏡對(duì)比度更高的圖像。
在結(jié)構(gòu)配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng) (包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)等部分。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、"光學(xué)切片"(Optical sectioning)、三維重建、動(dòng)態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn)，因而為表面分析及生物醫(yī)學(xué)等研究提供了有效手段。
