蔡司顯微鏡和艾克發(fā)生物將聯(lián)合提供解決方案

　　近些年，腫瘤免疫微環(huán)境(TiME)成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)熱門的話題，也吸引了大批研究人員的注意力。一篇又一篇文獻(xiàn)在期刊上不斷發(fā)表，人類對(duì)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等的認(rèn)識(shí)也不斷加深。在眾多相關(guān)文獻(xiàn)中，我們經(jīng)常可以看到一張張絢麗的多重免疫組化(mIHC)的圖像。

　　為什么這么多研究人員都選擇mIHC技術(shù)呢?主要是因?yàn)槟[瘤免疫微環(huán)境的復(fù)雜性和多樣性，為了更好的了解不同類型細(xì)胞的分布和相互關(guān)系，需要同時(shí)對(duì)多種生物標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)記。

　　但是在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，mIHC 卻讓人很頭疼。如何選擇抗體、如何進(jìn)行標(biāo)記、如何進(jìn)行染料搭配等等問題讓實(shí)驗(yàn)變得耗時(shí)耗力，結(jié)果還往往不理想。

　　如何將 mIHC 從科研的攔路虎變成高分文獻(xiàn)的助推器?這需要技術(shù)層面提供更全面的解決方案和數(shù)據(jù)分析能力。下面我們會(huì)以非小細(xì)胞肺癌樣本的染色為例，為大家展示如何利用該技術(shù)進(jìn)行腫瘤免疫微環(huán)境的研究。

　　我們將非小細(xì)胞肺癌樣本的11個(gè)常見腫瘤免疫相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行了染色標(biāo)記和全切片成像。

　　(photo by ZEISS Axioscan7, 該設(shè)備可對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境研究中的多色熒光標(biāo)記切片進(jìn)行更高效率、更高質(zhì)量的成像。)

　　11-plex的多靶點(diǎn)免疫組化結(jié)果可獲取211種表型信息，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究方向如免疫細(xì)胞分型、三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等，可以組成不同Panel組合分別進(jìn)行分析。下面是一些常見的研究方向?qū)?yīng)的組合信息。

　　免疫細(xì)胞分型研究

　　免疫細(xì)胞分型研究包括了CD3，CD4，CD8，CD45RO，PANCK，共計(jì)5個(gè)生物標(biāo)記物(見圖3)。PANCK(綠色)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，其余可精準(zhǔn)分型T細(xì)胞(CD3+)、輔助T細(xì)胞(CD3+CD4+)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3+CD8+)、記憶輔助T細(xì)胞(CD3+CD4+CD45RO+)和記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3+CD8+CD45RO+)。

　　三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)研究

　　三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(TLSs)是存在于腫瘤或很多炎癥部位周圍的異位淋巴結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和功能與次級(jí)淋巴器官相似，是TiME中抗腫瘤免疫應(yīng)答啟動(dòng)的直接部位，對(duì)患者的生存預(yù)后、治療反應(yīng)及免疫治療應(yīng)答評(píng)估都有積極的作用。TLSs的組成一般包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞、成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等[1]。

　　三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)研究包括了CD3，CD20，KI67，PANCK，共計(jì)4個(gè)生物標(biāo)記物(見圖4)。PANCK(綠色)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，其余可精準(zhǔn)分型T細(xì)胞(CD3+)和B細(xì)胞(CD20+)，KI67可觀察各細(xì)胞的增殖情況。

　　對(duì)CD3+細(xì)胞進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見圖5，圖中紅色是CD3+細(xì)胞表達(dá)豐度高的區(qū)域，黃色到綠色是表達(dá)豐度下降的區(qū)域。

　　對(duì)結(jié)果進(jìn)行空間近鄰分析，以PANCK為中心，可得到CD3+細(xì)胞與PANCK+細(xì)胞的平均距離為37.40 μm(結(jié)果見圖6)。

　　腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞研究

　　腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)研究包括了CD3，TIM3，PD-L1，CD68，PANCK，共計(jì)5個(gè)生物標(biāo)記物(見圖7)。PANCK(綠色)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞;分別統(tǒng)計(jì)腫瘤和間質(zhì)區(qū)域內(nèi)的CD8+細(xì)胞(紅色)的百分比，確認(rèn)浸潤(rùn)程度;TIM3標(biāo)記腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞功能失調(diào)的亞群，可作為實(shí)體瘤的預(yù)后標(biāo)志物;PD-L1表達(dá)情況確認(rèn)是否采用該靶點(diǎn)進(jìn)行免疫治療;同時(shí)可對(duì)巨噬細(xì)胞(CD68+)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(CD68+PD-L1+)進(jìn)行數(shù)量、密度和百分比的統(tǒng)計(jì)分析。

　　進(jìn)行浸潤(rùn)分析(見圖8)，劃分腫瘤和間質(zhì)邊界(圖中黃線)，以100 μm的閾值分別向腫瘤中心和間質(zhì)區(qū)域進(jìn)行浸潤(rùn)分析，統(tǒng)計(jì)不同浸潤(rùn)區(qū)域內(nèi)CD8+細(xì)胞的數(shù)量、密度和百分比(見表1)。

　　腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞研究

　　巨噬細(xì)胞研究包括了CD68，CD163，PD-L1，PANCK，共計(jì)4個(gè)生物標(biāo)記物(見圖9)。PANCK(綠色)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞;CD68標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞，CD163標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞;PD-L1+CD163+標(biāo)記腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)。

　　上面是我們列舉的12色多重免疫組化染色中的部分研究Panel。除此以外，還可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求組成更多不同的組合?？赐晟厦娴膶?shí)際案例，您是否也有興趣設(shè)計(jì)自己的染色方案，窺探腫瘤免疫微環(huán)境奧秘?蔡司顯微鏡和艾克發(fā)生物將聯(lián)合為您提供從染色標(biāo)記到掃描成像，再到數(shù)據(jù)分析的整套解決方案。